Criteri di terapia antimicotica

 

In contrasto con il gran numero di antibiotici e chemioterapici rivelatisi efficaci nel trattamento delle infezioni batteriche, la realizzazione di farmaci antifungini utilizzabili per via generale ha incontrato grandi difficoltà riferibili alla comune struttura eucariotica delle cellule fungine ed animali, che rende difficile l'individuazione dì bersagli metabolici o strutturali sufficientemente specifici.

Nella parete cellulare fungina, la chitina rappresenta un costituente fondamentale del setto che separa la cellula in accrescimento e riveste una particolare importanza nella transizione di forma tra micelio e lievito. Il ruolo cruciale nella cellula fungina e la sua assenza nelle cellule animali rendono i processi di sintesi e di idrolisi della chitina bersagli ideali per una potenziale terapia antimicotica.

Per specificità d'azione, gli inibitori della chitinasi possono presentare vantaggi teorici rispetto agli inibitori della chitin-sintetasi. La chitinasi, un enzima deputato alla degradazione della chitina e che   svolge funzioni essenziali nella divisione cellulare, può risultare aggredibile da molecole esogene a prescindere dal trasporto attraverso la membrana citoplasmatica.

Il fondamentale ruolo fisiologico e la diversa composizione in steroli (ergosterolo nelle cellule fungine e colesterolo in quelle animali) caratterizza la membrana citoplasmatica e il reticolo endoplasmico dei miceti come un possibile bersaglio per l'azione di antimicotici con sufficiente indice terapeutico.

A livello della membrana citoplasmatica, un ulteriore bersaglio metabolico può essere considerato la sintesi dei glucani, processo biosintetico per il quale sono stati individuati numerosi inibitori (papulocandina B, echinocandina B, aculeacina A, cilofungin).

La papulocandina B, così come i composti correlati echinocandina B ed aculeacina A, inibitori della sintesi dei glucani, è un peptide ciclico con uno spettro d'azione antifungino ristretto ad alcune specie di lieviti in relazione alla lisi delle cellule in blastogonia e degli apici delle cellule germinanti. La papulocandina B è una molecola anfotera nella quale la porzione idrofilica contiene residui di glucoso e galattoso e quella idrofobica due acidi grassi insaturi parzialmente idrossilati. E' stato osservato che l'effetto della molecola sulla distribuzione di glucoso marcato radioattivamente  in varie frazioni polisaccaridiche di protoplasti fungini in rigenerazione si esplica come inibizione dell'incorporazione di mannoproteine e glucani.

Di potenziale interesse terapeutico, in relazione ad un effetto sinergico con l'amfotercina B, sembra essere un derivato semisintetico dell'echinocandina, il cilofungin, in grado di inibire competitivamente la sintesi del P 1-3 D-glucano degli strati parietali con alterazione della funzione selettiva di membrana, rilascio di materiale citoplasmatico nell'ambiente esterno e conseguente morte cellulare. Per quanto relativamente atossico, il cilofungin potrebbe trovare applicazione esclusivamente nel trattamento delle micosi causate da lieviti, e da Candida albicans in particolare, essendosi dimostrato inefficace nei confronti delle muffe.

Possibili bersagli biosintetici, anzichè strutturali, possono essere considerati, nei funghi, la sintesi del DNA ed RNA, la fosforilazione ossidativa e l'ATPasi delle membrane mitocondriali e vacuolari. Non va trascurata, inoltre, la capacità degli antimicotici, in particolare a concentrazioni subinibenti, di interferire con i processi di adesione dei miceti alle cellule delle mucose e di stimolare la risposta immunitaria, contribuendo indirettamente all’efficacia del trattamento terapeutico o profilattico.

E' ragionevole ipotizzare che i funghi, così come i batteri, siano intrinsecamente in grado di sviluppare resistenze all'azione degli antifungini. Mutanti resistenti possono preesistere tra i cloni sensibili con frequenza variabile e, in funzione di questa resistenza primaria, può, nel corso dell'infezione e del trattamento terapeutico, svilupparsi una resistenza secondaria che potrebbe essere considerata la causa principale del fallimento terapeutico.

L'incremento delle conoscenze della biologia fungina e la pressione della richiesta clinica ha consentito, negli ultimi anni, la produzione commerciale di alcune molecole sufficientemente efficaci e relativamente atossiche da poter essere usate, sia pure con prudenza, nella cura delle micosi profonde di cui hanno radicalmente migliorato la prognosi.

E' importante sottolineare come gli antibiotici antifungini possono esplicare attività antibatterica ed antiprotozoaria mentre i farmaci antibatterici sono sempre inattivi nei confronti dei miceti.

Farmaci antifungini

 

5-F1uorocitosina

 

La 5-fluorocitosina è un analogo delle pirimidine ed è stata sviluppata inizialmente come farmaco antineoplastico. Questo composto ha un'attività inibinte nei confronti di molte specie di lieviti e agenti eziologici di cromoblastomicosi, mentre risulta meno efficace nei confronti di alcune muffe.

La possibilità di assorbimento a livello intestinale e di superamento della barriera ematoencefalica rendono la 5-fluorocitosina idonea per il trattamento delle candidosi profonde.

L'efficacia del farmaco, consigliabile per la relativa atossicità, è peraltro limitata dal frequente riscontro di resistenze primarie e secondarie nei ceppi di C. albicans.

L'effetto sinergico rilevabile nell'associazione tra 5-fluorocitosina ed amfotercina B sembra essere riferibile alla maggiore permeabilizzazione della membrana, causata dal derivato polienico, all'accesso intracellulare della 5-fluorocitosina.

Il meccanismo di azione e la selettività dell'antimicotico è riferibile all'incapacità da parte dell'ospite a convertire la citosina in uracile in quanto la citosina-deaminasi risulta assente, o scarsa, nelle cellule dei mammiferi.

La variabilità nel meccanismo di acquisizione della 5-fluorocitosina rende ragione della frequente resistenza all'antimicotico mostrata da varie specie e ceppi di lieviti.

I ceppi divenuti resistenti alla 5-fiuorocitosina rimangono solitamente sensibili all'azione dei derivati polienici ed azolici.

 

 

I derivati polienici

 

I derivati polienici sono il prodotto del metabolismo di alcune specie del genere Streptomyces, un actinomicete da cui possono essere estratti con adatti solventi. La scarsa idrosolubilità è, infatti, una delle maggiori limitazioni all'utilizzo di questi composti.

I polieni (amfotercina B, nystatina) sono un gruppo di macrolidi prodotti anche per sintesi, caratterizzati da una serie di doppi legami alternati (tetraeni, eptaeni) e da un grande anello lattonico cui si riferisce l'attività antibiotica.

Tali composti agiscono, dopo superamento della parete cellulare, danneggiando la membrana citoplasmatica delle cellule eucariotiche con conseguente alterazione della permeabilità osmotica e delle funzioni di trasporto di metaboliti essenziali. Per la loro conformazione molecolare, essi presentano una avidità maggiore, mediata da forze di van der Waals, per l'ergosterolo della membrana citoplasmatica delle cellule fungine che per il colesterolo di quelle animali, mostrando, di conseguenza, una certa selettività che conferisce loro un adeguato indice terapeutico nonostante un notevole grado di tossicità, soprattutto a livello renale. La distruzione della permeabilità selettiva della membrana citoplasmatica da parte dei polieni attraverso la formazione di pori composti da piccoli aggregati del farmaco e da steroli, causa il rilascio di cationi nell'ambiente extracellulare e l'acquisizione di protoni (ioni idrogeno) con conseguente depolarizzazione della membrana ed acidificazione dell'ambiente intracellulare.

I danni ossidativi prodotti sulla membrana citoplasmatica potrebbero essere la causa della morte cellulare, in quanto i protoplasti fungini risultano protetti dall'azione dei polieni per apporto esogeno di catalasi. Mutanti resistenti all'attività fungistatica e fungicida dell'amfotercina B mostrano livelli di tale enzima fino a 20 volte maggiori rispetto a quelli dei ceppi selvaggi sensibili.

I derivati polienici possono essere somministrati per via topica ed endovenosa, non essendo significativamente assorbiti a livello intestinale.

L'incapsulamento dei derivati polienici, amfotercina B e nystatina, in liposomi, così come l'esterificazione delle molecole, si è dimostrato un efficace metodo per superare la tossicità intrinseca dei farmaci. Il razionale del trattamento si basa sul fatto che sia i liposomi sia i parassiti fungini vengono fagocitati dai macrofagi veicolando i derivati polienici in contatto con gli agenti infettanti. L'amfotercina B liposomiale presenta un'attività fungistatica e fungicida in vitro comparabile a quella dell'antimicotico libero. Il danno endoteliale capillare e l'incremento del numero di cellule fagocitarie possono contribuire ad una diffusione preferenziale del farmaco liposomiale agli organi maggiormente infettati dai funghi.

Un importante effetto correlato all'azione di questi composti sembra essere la stimolazione della risposta immunitaria dell'ospite, con un meccanismo di immunomodulazione in cui i macrofagi sono le più importanti cellule bersaglio.

L'attivazione sarebbe riferibile ad un effetto diretto sulla membrana cellulare e rilascio di tumor necrosis factor probabilmente responsabile delle manifestazioni febbrili associate all'uso del farmaco.

I ceppi resistenti presentano, generalmente, una membrana citoplasmatica ad alterato contenuto di ergosterolo, sebbene non possa essere trascurata la possibilità, verificata in alcuni dermatofiti, della produzione di enzimi in grado di inattivare i composti polienici.

 

Nystatina

 

La nystatina isolata nel 1949 da Streptomyces noursei è stato il primo antibiotico polienico utilizzato estensivamente.

Pur essendo attiva a basse concentrazioni (1,5-1,3 ng/ml) su un elevato numero di specie fungine, la sua tossicità, quando iniettata per via parenterale, e lo scarso o nullo assorbimento intestinale, quando assunta per via orale, ne precludono l'uso nella terapia delle micosi profonde. L'impiego è limitato al trattamento per uso topico delle forme di candidosi superficiali o gastrointestinali, per somministrazione orale, anche in associazione con 5-fluorocitosina di cui contribuisce a ridurre l'induzione di resistenza. L'incapsulamento della nystatina in liposomi può contribuire a ridurre la tossicità del farmaco quando somministrato per via endovenosa.

La nystatina, quasi insolubile in acqua ed alcool, agisce legandosi ad uno specifico sterolo (l'ergosterolo) della membrana citoplasmatica dei funghi sensibili, alterandone la permeabilità. Tale fenomeno può essere la risultante della dislocazione di specifici domini lipidici oppure la conseguenza dell'inibizione di enzimi specifici di membrana quali l'ATPasi.

 

Amfotercina B

 

L'amfotercina B, prodotto di fermentazione naturale di Streptomyces nodosus isolato in Venezuela nel 1953, è un antibiotico a larghissimo spettro antimicotico.

L'amfotercina B è somministrabile per via sistemica (endovenosa ed intratecale) ed essendo altamente insolubile in acqua, per l'uso parenterale viene utilizzata come sospensione colloidale nell'agente disperdente deossicolato di sodio o complessata con steroli. Di scarso ed imprevedibile assorbimento intestinale, dopo somministrazione per via endovenosa (alla dose di 10mg/kg die) circa il 95% dell'amfotercina B si trova legata alle lipoproteine del siero e la sua emivita nel plasma è di circa 24 ore. Effetti sinergici sono stati rilevati nell'uso terapeutico di amfotercina B combinata con la 5-fluorocitosina,  anche se granulocitopenia e trombocitopenia dovute a 5-fluorocitosina sono state osservate in concomitanza ad uno stato azotemico causato da amfotercina B.

L'amfotercina B, per quanto presenti un'elevata nefrotossicità (danni a livello dei tubuli renali) e possa causare iperpiressia, ipotensione, tromboflebiti, ipocalcemia ed epatite, ha rappresentato il primo composto efficace utilizzabile per il trattamento delle micosi profonde o disseminate e rimane l'antimicotico di scelta per la terapia empirica delle micosi. Un trattamento con cloruro di sodio si è dimostrato utile, quando possibile, nella prevenzione della nefrotossicità indotta dal farmaco. L'amfotercina B può causare, inoltre, anemia normocromica e normocitica associata a iposideremia riferibile a tossicità diretta sul midollo osseo o soppressione, reversibile, della produzione di eritropoietina.

La possibilità dell'insorgenza di ceppi fungini resistenti nei confronti dell'amfotercina B è stata molto dibattuta ed è tuttora controversa.

Si è a lungo ipotizzato che l'alterazione dell'ergosterolo, il componente cui si lega l'amfotercina B, fosse incompatibile con la sopravvivenza della cellula fungina. In questa prospettiva, mutanti resistenti all'amfotercina B non dovrebbero sussistere, richiedendosi una mutazione letale e considerando inoltre la tendenza dell'amfotercina B a produrre grosse micelle che potrebbe assicurare un'esposizione ottimale dei funghi ad elevate concentrazioni dell'antibiotico. Effettivamente, resistenze all'amfotercina B sono state riscontrate in ceppi di C. tropicalis, C. parapsilosis e C. lusitaniae isolati da pazienti neutropenici o trattati con sostanze citotossiche. La mutazione era riferibile ad un'alterazione, qualitativa e/o quantitativa, degli steroli della membrana cellulare e conseguente perdita del sito di legame rappresentato dall'ergosterolo. I fenotipi opachi di ceppi switching di C. albicans che presentano una modificazione degli steroli della membrana citoplasmatica sono più resistenti al farmaco. E' stato inoltre ipotizzato come l'uso contemporaneo di ketoconazolo ed amfotercina B possa indurre una resistenza verso il derivato polienico attraverso un meccanismo per cui il derivato imidazolico previene la sintesi dell'ergosterolo. Cellule di C. albicans sono più sensibili a dosi massicce di amfotercina B che ad una quantità equivalente somministrata in piccole dosi, forse in relazione ad una accresciuta attività catalasica.

Alcuni aspetti della farmacocinetica dell'amfotercina B, che è risultata diversa nei bambini e negli adulti, sono ancora da chiarire sebbene si ritenga che una quota del farmaco venga immagazzinata temporaneamente nel fegato, milza e rene. La concentrazione dell'antimicotico risulta estremamente ridotta nelle urine e quasi indeterminabile nel liquor mentre almeno una frazione della dose somministrata viene escreta con la bile.

L'amfotercina B ha dimostrato di possedere attività immunomodulatoria. In relazione alla concentrazione, il farmaco può stimolare i macrofagi a produrre maggiori quantità di prostaglandina E2 e i monociti a produrre interleuchina 1.

L'amfotercina B ha un effetto analogo al BCG o all'adiuvante completo di Freund ed ha, inoltre, effetto sull'immunità cellulo-mediata interagendo con i linfociti T soppressori che possono causare un'anergia spesso associata con le micosi disseminate. L'interazione tra amfotercina B ed il sistema immunitario, estremamente complessa, dovrebbe quindi essere attentamente valutata nello stabilire la specifica azione antifungina del farmaco.

 

I derivati azolici

 

I derivati azolici sono un gruppo di chemioterapici di sintesi, sia imidazolici (clotrimazolo, econazolo, ketoconazolo, miconazolo, tioconazolo) sia triazolici (itraconazolo, fluconazolo) tuttora in fase di espansione (butoconazolo, fenticonazolo, omoconazolo, saperconazolo, sulconazolo). Quasi insolubili in acqua, sono peraltro solubili nei solventi organici ed il potenziale effetto inibitorio è riferibile comunemente alla presenza di anelli aromatici in posizione N1 nell'anello azolico. I derivati azolici possiedono anche attività antibatterica, limitatamente ai batteri Gram-positivi.

Alcuni di essi hanno trovato ampia applicazione terapeutica, sia per uso topico nel trattamento delle micosi superficiali, sia per via orale od endovenosa nella cura delle micosi profonde, alla dose di 300-600 mg di ketoconazolo die.

In genere, i derivati azolici causano un'alterazione nella biosintesi dell'ergosterolo delle membrane del reticolo endoplasmico e mitocondriali dei miceti sensibili alterandone la fluidità, in funzione della loro attività sul citocromo P450, una emoproteina che catalizza la demetilazione di un precursore specifico, il lanosterolo.

La fase terminale del processo biosintetico dell'ergosterolo è il bersaglio effettivo di una lunga serie di composti antifungini utilizzabili a scopo terapeutico.

L'interazione dei composti azolici con P450 risulta in una inibizione della sintesi dell'ergosterolo e, poiché questo costituente cellulare è pregiudiziale per la proliferazione cellulare fungina, tale interferenza appare come la causa principale dell'arresto della crescita. L'inibizione della biosintesi dell'ergosterolo coincide con l'accumulo di steroli 14-metilati che inducono alterazioni nella  permeabilítà di membrana, alterazioni al suo patrimonio enzimatico, inibizione di crescita e morte cellulare.

Ad elevate concentrazioni, i derivati azolici, per uso topico, possono esercitare la propria azione danneggiando direttamente la membrana cellulare, manifestando peraltro alcuni indesiderabili effetti collaterali (epatotossicità, disordini ormonali con l'induzione di lievi alterazioni nella biosintesi del testosterone).

I derivati azolici possono, ad adeguate concentrazioni, inibire la transizione di forma da lievito a micelio, interagendo sui lipidi della membrana cellulare che, col loro metabolismo, governano il processo di morfogenesi fungina specialmente attraverso la sintesi dei P glucani. Tali farmaci, ed il clotrimazolo in particolare, hanno mostrato di essere più attivi nei confronti di cellule germinanti che di blastoconidi di C. albicans. Cellule di C. albicans pretrattate con concentrazioni subletali di derivati azolicí si mostrano meno virulente, sperimentalmente, di quelle normali.

A causa della scarsa correlazione con i saggi di sensibilità in vitro, è difficile valutare, in vivo, il fenomeno di insorgenza di resistenza nei miceti ai derivati azolici nel corso di prolungati trattamenti terapeutici.

L'induzione di resistenza ai derivati azolici è, comunque, assai difficile da realizzarsi in vitro. Nei casi sperimentali in cui è stata ottenuta, la resistenza sembra essere correlata più a variazioni nelle caratteristiche di membrana che ad una modificazione delle attività enzimatiche. E' stato ipotizzato che la comune resistenza di ceppi fungini a derivati polienici ed azolici sia da riferire ad un più elevato contenuto in lipidi e ad un ridotto rapporto tra lipidi polari e neutri comparativamente ai ceppi sensibili. L'alterato rapporto lipidico della membrana citoplasmatica potrebbe prevenire il legame dei polieni e ridurre la permeabilità degli azoli. Studi biochimici e genetici hanno evidenziato che mutanti resistenti al miconazolo sono correlati ad un gene del DNA mitocondriale per la produzione di una subunità di ATPasi insensibile all'azione del farmaco, mentre la resistenza al ketoconazolo è mediata da una mutazione di geni nucleari.

Contrastanti effetti, antagonistici, sinergici ed additivi sono stati rilevati sperimentalmente nell'uso dell'associazione tra derivati azolici e polienici. L'antagonismo può essere riferito all'interazione dei derivati azolici con l'ergosterolo della membrana citoplasmatica costituendo una maggiore resistenza sequenziale ai derivati polienici per riduzione dello specifico bersaglio cellulare. Poiché l'associazione tra derivati azolici e 5-fluorocitosina può comportare effetti indifferenti od addizionali, non vi sono ragioni specifiche per utilizzare, od evitare, il loro uso terapeutico combinato.

Nelle terapie antifungine inoltre, vanno anche tenute presenti considerazioni di ordine più generale, per valutare più correttamente quanto si riesce a raggiungere con i farmaci utilizzati.

Una stretta correlazione, ad esempio, tra efficacia antibiotica in vitro e risposta clinica in vivo risulta legata a molti parametri variabili che, a seconda delle circostanze, possono essere interpretati positivamente o con diffidenza. Valutazioni contraddittorie, a volte, possono essere desunte dal trattamento di pazienti che mostrano risoluzione clinica in condizioni terapeutiche dimostratesi inefficaci in altri soggetti affetti da micosi con le stesse caratteristiche cliniche. Non bisogna, peraltro, fraintendere il significato della parola «cura» in relazione ad una terapia antifungina. Con «cura» si potrebbe intendere, troppo soggettivamente, un accresciuto senso di benessere fisico, la completa risoluzione delle lesioni, oppure l'eradicazione dell'agente eziologico senza alcun riferimento al tempo. Un ragionevole criterio potrebbe essere definire come «cura» una negativizzazione dell'esame colturale e sierologico oltre alla completa risoluzione clinica, istologica e radiologica della lesione fino ad un anno dopo la fine del trattamento terapeutico. L'adozione di un tempo più prolungato (5 anni come in oncologia) potrebbe collidere con la normalità di frequenti recidive e la difficoltà, a volte, di poter estendere tali lunghi periodi di osservazione ai pazienti, specialmente se questi siano in uno stato di relativo benessere. «Cura», peraltro, non è il solo termine che necessiti di un'accurata definizione. Altri, come «fallimento», «miglioramento» e «recidiva» meritano particolare considerazione in quanto una vaga definizione dei termini può complicare al medico l'interpretazíone dei risultati ottenuti con l'antimicotico in esame sia in vitro sia in vivo.

Per tutte le considerazioni esposte, oltre che per il terremo estremamente complesso e misterioso in cui ci si deve muovere, la terapeutica antimicotica attualmente proposta sembra essere molto lontana da un livello ottimale accettabile; di qui il continuo richiamo, da parte di tutti gli studiosi e i ricercatori, ad un rinnovamento totale dell’armamentario terapeutico antifungino, in modo da risolvere quelle infezioni che al momento rappresentano una delle cause di morte più frequenti per il malato neoplastico.

Chissà che nel futuro non si riesca a risolvere, insieme alle micosi, anche il problema cancro.